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Avaliação de genótipos, endossimbiontes e características clínicas de Acanthamoeba recuperada de infecção ocular

Aug 11, 2023Aug 11, 2023

BMC Infectious Diseases volume 22, número do artigo: 757 (2022) Citar este artigo

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Acanthamoeba é um patógeno emergente, famoso por sua resiliência contra compostos antiprotozoários, desinfetantes e ambientes agressivos. É conhecido por causar ceratite, uma infecção da córnea que ameaça a visão, é dolorosa e difícil de tratar, frequentemente relatada entre usuários de lentes de contato e pacientes com trauma ocular. Acanthamoeba compreende mais de 24 espécies e atualmente 23 genótipos (T1-T23) foram identificados.

Este estudo retrospectivo foi desenhado para examinar as espécies e genótipos de Acanthamoeba recuperados de pacientes com ceratite por Acanthamoeba (AK), determinar a presença de endossimbiontes em isolados oculares de Acanthamoeba e revisar as apresentações clínicas.

Treze pacientes com QA confirmada por cultura tratados em um centro oftalmológico terciário em Hyderabad, Índia, de fevereiro a outubro de 2020, foram incluídos neste estudo. As manifestações clínicas, medicamentos e resultados visuais de todos os pacientes foram obtidos dos prontuários médicos. Os isolados de Acanthamoeba foram identificados por sequenciamento do gene da subunidade nuclear ribossômica (rns). Os isolados de Acanthamoeba foram avaliados quanto à presença de endossimbiontes bacterianos ou fúngicos utilizando ensaios moleculares, PCR e hibridização in situ fluorescente (FISH).

A média de idade dos pacientes foi de 33 anos (DP ± 17,4; IC 95% 22,5 a 43,5 anos). Seis (46,2%) casos apresentavam fatores de risco associados a QA; quatro pacientes apresentaram trauma ocular e dois eram usuários de lentes de contato. A. culbertsoni (6/13, 46,2%) foi a espécie mais comum, seguida por A. polyphaga e A. triangularis. A maioria dos isolados (12/13) pertencia ao genótipo T4 e um era T12; três subgrupos T4A, T4B e T4F foram identificados dentro do genótipo T4. Não houve associação significativa entre os tipos de Acanthamoeba e os desfechos clínicos. Oito (61,5%) isolados abrigavam bactérias intracelulares e um continha Malassezia restrita. A presença de micróbios intracelulares foi associada a uma maior proporção de infiltrados estromais (88,9%, 8/9), defeito epitelial (55,6%, 5/9) e hipópio (55,6%, 5/9) em comparação com 50% (2/ 4), 25% (1/4) e 25% (1/4) de casos de AK sem micróbios intracelulares, respectivamente.

O genótipo T4 foi o isolado predominante no sul da Índia. Este é o segundo relato do genótipo T12 identificado em pacientes com QA na Índia, o que raramente é relatado em todo o mundo. A maioria dos isolados clínicos de Acanthamoeba neste estudo abrigava micróbios intracelulares, o que pode impactar as características clínicas da AK.

Relatórios de revisão por pares

A ceratite por Acanthamoeba (AK) é uma doença ocular rara, responsável por 2% das infecções globais da córnea [1]. No entanto, talvez devido ao aumento do uso de lentes de contacto e ao aumento da prevalência de espécies de Acanthamoeba em diferentes recursos hídricos, incluindo piscinas artificiais e até mesmo fontes de água doméstica tratada [2], os casos de AK estão a aumentar globalmente. O uso de lentes de contato está aumentando em todo o mundo, em parte devido ao desenvolvimento de lentes de contato que podem controlar a progressão da miopia em crianças, e isso pode colocá-las em risco de desenvolver infecções por AK que podem levar à cegueira [3]. A ligação entre AK e uso de lentes de contato está firmemente estabelecida, sendo o uso de lentes de contato associado a quase 90% das infecções relatadas [4]. Os surtos relatados foram associados a soluções ineficazes de desinfecção de lentes de contato [5, 6]. O ciclo de vida da Acanthamoeba inclui um trofozoíto infeccioso e o estágio de cisto dormente; podendo este último permanecer viável durante vários anos [7].

AK é difícil de diagnosticar e existem regimes de tratamento eficazes muito limitados [8, 9]. Os cistos de Acanthamoeba são resistentes a desinfetantes, medicamentos antiprotozoários e esgotamento de nutrientes, representando um desafio formidável para o atendimento ao paciente [10]. Além disso, muitos dos medicamentos comuns para tratar infecções oculares não são eficazes para Acanthamoeba. Como o diagnóstico e o tratamento de pacientes com QA são difíceis, isso pode levar a uma medicação prolongada e o tratamento bem-sucedido torna-se extremamente difícil, levando à perda substancial da visão [11]. Intervenções cirúrgicas são necessárias em 30% dos pacientes com QA para controlar a doença e, em casos raros, o olho infectado é removido [12]. Além disso, os cistos de Acanthamoeba são difíceis de erradicar após o estabelecimento da infecção, e isso pode resultar na recorrência da infecção [13]. O diagnóstico correto é essencial para o sucesso da terapia, mas como os sinais e sintomas clínicos da QA variam e alguns são semelhantes a outras infecções oculares, como a ceratite pelo vírus herpes simplex (HSV), o diagnóstico pode ser desafiador. É provável que analgésicos, antiinflamatórios e compostos antimicrobianos em geral sejam prescritos enquanto o diagnóstico é estabelecido. O uso prévio de corticosteroide tópico antes do diagnóstico de infecção corneana por Acanthamoeba está associado a pior resultado visual [14]. AK com suspeita de resistência a soluções de lentes de contato multifuncionais e remédios antiamebais estabelecidos necessitam de modalidades diagnósticas sensíveis com novas abordagens terapêuticas [15].

 90% trophozoites) grown axenically were collected in 1.5 ml eppendorf tubes and centrifuged for 5 min at 3,000 g to harvest trophozoites. The cell pellet was washed twice with 1X Page’s saline and 30µL of amoebic suspension was transferred on poly-l-lysine coated slides (Thermo Scientific, Braunschweig, Germany) and left for 30 min at ambient temperature. The adherent cells were fixed by applying 30µL of freshly prepared 4% formaldehyde (buffered, pH 6.9) for 25 min. The attached amoebal cells were washed with 1X PBS, dehydrated in increasing ethanol concentrations (50%, 80%, and 96%, 3 min each) and air-dried. Intracellular bacteria were examined by hybridization using Cy3 labelled bacterial-domain specific probe EUB338 [41], and fungi using the fungus-specific probe PF2 conjugated with Hex and a Cy5 labelled EUK516 probe (Table 1) [42] for eukaryotic 18S rRNA (Biomers, Ulm, Germany). Aliquots (1µL of 50 ng/µL) of each probe were mixed with 9µL of hybridization buffer (20 mM Tris–HCl, pH 7.1, 900 mM NaCl, and 20% v/v formamide, 0.01% SDS) and added to the fixed amoebal cells on slides. Hybridization was carried out for at least 90 min at 46 °C in the dark after which slides were rinsed with 20µL of pre-warmed (48 °C) buffer (180 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.2, and 0.01% SDS). The slides were then covered with 200µL buffer and a washing step was performed at 48 °C for 25 min. All slides were quickly immersed in ice-cold MilliQ water, air dried, and were mounted using Prolong Diamond Antifade with DAPI (Thermo Fisher Scientific), then mounted slides were left overnight to cure at room temperature in the dark before imaging. Three independent assays were performed and at least 30 amoebal host cells were visualized under Olympus FV1200 confocal laser scanning microscope in Katharina Gaus Light Microscopy Facility of UNSW and FISH images were analysed in ImageJ [43]./p> 0.05). Two patients (25%, 2/8) infected by Acanthamoeba with bacterial endosymbionts had received antibiotics along with antiamoebic drugs and the ulcers of both cases were resolved after medication./p> 4 mm) was observed in 3 (23.1%) cases. Epithelial defect was noted in 6 cases (46.2%; 6.2 ± 1.7 mm), stromal infiltrates in 10 cases (76.9%; 5.0 ± 2.2 mm), and hypopyon in 6 cases (46.1%; 1.12 ± 0.6 mm). The median duration of symptoms onset was 20 days (IQR = 15—30) and the final visual acuity was not improved by ≥ 2 lines among patients with farming background (5/5, 100%), age > 32 years (4/6, 80%) and patients showing AK symptoms more than 20 days (3/6, 50%) (Additional file 1: Table S3). PHMB and chlorohexidine were the most common treatments in this study (11 cases; 84.6%). Three cases received antibiotics, one case antiviral and one case antifungal as supportive therapy (38.5%); for these there was no improvement (p > 0.05) in BCVA at final presentation compared to cases treated only with PHMB and chlorohexidine. Overall, the median duration of medical treatment was 38 days (IQR = 23—90). Of six cases with surgical treatment, 4 cases had therapeutic penetrating keratoplasty (TPK, n = 4), including one case that had an amniotic membrane transplant (Table 4). Of the remaining two cases, one had photodynamic antimicrobial therapy with rose bengal (RB-PDAT) and one underwent evisceration. Among 6 patients who had to undergo ocular surgery, 66.7% (4/6) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria./p> 32 years (80%) and cases showing keratitis symptoms for > 20 days (50%). A study from the UK has also reported worst clinical outcomes for AK patients aged > 34 years [56]. Corneal integrity weakens with age and the higher incidence of dry eyes among older populations may be possible predisposing factor for severe form of AK [9]. A previous study of bacterial keratitis from LVPEI supports the association of epithelial defect size with VA loss found in the current study [57]. Patients’ professions are often linked with the risk factors [55]. In the current study, among five cases having farming background, four (80%) had history of ocular trauma which may have been caused by non-sterile external matters as framers are frequently exposed to outdoor activities and three patients (75%, 3/5) were infected by Acanthamoeba strains with intracellular bacteria. All four cases had to undergo ocular surgery but visual acuity was not improved even after postoperative recovery. Ocular trauma with contaminated objects may be an ideal vehicle for invasion of Acanthamoeba cells leading to severe form of AK. Approximately 90% of AK patients with history of eye injury had corneal grafts to restore vision in Southern China [58]./p>

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